Regulation, activation, and deactivation of soluble guanylate cyclase and NO-sensors
Régulation, activation et désactivation de la guanylate cyclase soluble et de senseurs du NO.
Résumé
This thesis is devoted to the regulation of soluble guanylate cyclase (sGC), the endogenous nitric oxide (NO) receptor in mammals involved in signal transduction. The enzyme is activated by the binding of NO to its heme and catalyzes the formation of cGMP from GTP. While sGC is present in many mammalian cells, the homologous bacterial domain (H-NOX) is involved in NO detection and metabolism regulation. An important objective was to find sGC inhibitors to slow down tumor progression.The screening of natural compounds from a chemical library, tested on purified sGC activity, revealed six active inhibitors (Ki = 0.2 – 1 µM). Together with two agents for photodynamic therapy (hypericin and hypocrellin) we demonstrated that these inhibitors are allosteric modulators which bind neither to the heme nor to the catalytic and activator sites, revealing a new class of pharmacological compounds targetting the NO/cGMP signaling pathway.The structural transition induced in sGC by stimulator riociguat in synergy with CO was studied by transient absorption spectroscopy to demonstrate coordination changes of the heme. Two different activation states of sGC with CO 6c-heme and 5c-heme exist simultaneously in the presence of the stimulator which induces the breaking of the heme Fe-His bond, as does the sGC natural effector NO. In addition, the effect of isoliquiritigenin, which is sold as a sGC activator, was shown to be actually an inhibitor of sGC.The dynamics of the ligands CO, NO and O2 were measured over 12 orders of magnitude in time in wild type and mutant of a bacterial NO transporter (AXCP). The single mutation Leu16Ala increased 108-fold the CO affinity, ~106-fold the NO affinity and makes this protein reactive to O2. In the case of CO and NO, whose affinities for L16A-AXCP are the largest ever measured, the bimolecular rebinding was absolutely not detectable. Molecular dynamic simulations demonstrated that dissociated CO is constrained to stay within 4 Å from Fe2+ by Ala16, contrarily to wild-type Leu16.The dynamics of O2 in Tt-H-NOX proteins measured by transient absorption spectroscopy confirmed the hypothesis that Tt-H-NOX may not be a NO-sensor stricto sensu but a redox sensor. The properties of the Tt-H-NOX protein are not compatible with the role a mere NO-carrier.
Cette thèse est consacrée à la régulation de la guanylate cyclase soluble (sGC), le récepteur endogène du monoxyde d'azote (NO) chez les mammifères qui est impliqué dans la transduction du signal. L'enzyme sGC est activée par la fixation du NO sur son hème et catalyse alors la formation du cGMP à partir du GTP. Alors que la sGC est présente dans de nombreuses cellules de mammifères, le domaine hémique bactérien homologue (H-NOX) est impliqué dans la détection du NO et la régulation du métabolisme. Un objectif important est la découverte d'inhibiteurs de la sGC pour ralentir la progression tumorale.Le criblage de composés naturels d'une chimiothèque mesurant l'activité de la sGC purifiée a révélé six inhibiteurs actifs (Ki = 0.2 – 1 µM). Avec deux autres composés actifs en photothérapie (hypericin et hypocrellin) nous avons démontré que ces inhibiteurs sont des effecteurs allostériques qui ne se fixent ni sur l'hème, ni sur le site catalytique ou de fixation des activateurs, découvrant une nouvelle classe de composés pharmacologiques ciblant la voie de signalisation NO/cGMP.La transition structurale induite par l'activateur riociguat en synergie avec le CO a été étudiée par spectroscopie d'absorption résolue en temps pour démontrer des changements de coordination de l'hème. Deux états d'activation distincts de la sGC par le CO existent simultanément avec les coordiantions 6c-hème et 5c-hème en présence de l'activateur qui induit la rupture de la liaison Fe-His de l'hème, à l'instar de l'activateur naturel NO. De plus, nous montrons que l'isoliquiritigénine, commercialisée comme activateur de la sGC, et en réalité un inhibiteur de la sGC.La dynamique ds ligands CO, NO, and O2 a été mesurée sur 12 ordres de grandeur temporelle pour le type sauvage et un mutant du transporteur bactérien du NO (AXCP). La simple mutation Leu16Ala augmente l'afinité pour le CO 108 fois, celle du NO 106 fois et rend cette protéine réactive à O2. Dans le cas de CO et NO dont les affinités pour L16A-AXCP sont les plus grandes jamais mesurées, la recombinaison bimoléculaire n'est pas détectable. Des simulations de dynamique moléculaire ont démontré que le CO dissocié est contraint de rester à 4 Å du Fe2+ par Ala16, contrairement au type sauvage Leu16.La dynamique de O2 a été mesurée dans la protéine senseur Tt H-NOX par spectroscopie d'absorption transitoire et confirme l'hypothèse que Tt H-NOX n'est sans doute pas un senseur de NO stricto sensu mais un senseur redox. Les propriétés de Tt-H-NOX ne sont pas compatibles avec le rôle d'un simple transporteur de NO.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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