Aptamers, as new tools for the study and detection of Anaplasma phagocytophilum, a strict intracellular zoonotic bacterium
Les aptamères, de nouveaux outils pour l'étude et la détection d'Anaplasma phagocytophilum, une bactérie zoonotique intracellulaire stricte
Résumé
Anaplasma phagocytophilum is a strict intracellular, zoonotic bacterium, transmitted by ticks of the Ixodes genus. This bacterium is responsible for granulocytic anaplasmosis in human and cattle and infects other mammals, such as wild ruminants and other susceptible domestic species. Many unanswered scientific questions remain, particularly regarding strain variability, epidemiological cycles and mechanisms of host-pathogen interaction. These gaps of knowledge are due to the difficulty to isolate and cultivate A. phagocytophilum, because of the few permissive cells available and the lack of specific tools, in particular monoclonal antibodies. Aptamers are oligonucleotides able to bind with high affinity and specificity to a wide range of targets. These innovative tools are a good alternative to monoclonal antibodies and powerful tools in infectiology (purification, detection or therapeutics tools…). The aim of my thesis was therefore to apply the aptamer technology to the study of A. phagocytophilum, using two approaches. The first approach was designed to select aptamers against A. phagocytophilum or molecules expressed during infection, using the SELEX (Systematic evolution of ligand by exponential enrichment) method. After selection, three aptamers showed a high affinity for HL-60 cells infected with the human American NY18 strain. They were able to recognize proteins that were expressed at different time points during infection. This approach is a first step in the identification of potential new molecules for diagnostic/therapeutic or research. The second approach was to select aptamers against Asp14, a surface protein of A. phagocytophilum. The selection was performed against the recombinant protein using a robotic platform. Eight aptamers specific to the recombinant Asp14 protein were obtained. Six of them recognized their target in a suspension enriched with bacteria. This second approach is a first step to obtain aptamers against infectious forms of A. phagocytophilum and to develop a method to capture bacteria from field samples. My work provides a comparison of these two approaches, applied to the same study model, A. phagocytophilum. It paves the way for the development of aptamers against other strict intracellular pathogenic bacteria, particularly those transmitted by arthropods, and for research that is part of the long-term One Health approach (reducing the use of antibiotics and/or acaricides).
Anaplasma phagocytophilum est une bactérie zoonotique intracellulaire stricte et transmise par les tiques du genre Ixodes. Elle est l'agent de l'anaplasmose granulocytaire humaine et bovine et infecte également d'autres mammifères, comme les rongeurs ou les ruminants sauvages, ainsi que d'autres espèces domestiques sensibles. De nombreuses questions de recherche persistent, concernant la variabilité des souches, les cycles épidémiologiques et les hôtes réservoirs des souches infectant les humains et les animaux domestiques. En outre, les mécanismes impliqués dans les interactions avec les hôtes vertébrés/invertébrés restent largement à explorer. Ces lacunes résultent de la difficulté à isoler et cultiver A. phagocytophilum, du fait du manque de cellules permissives au laboratoire et d'outils spécifiques susceptibles de permettre son étude, notamment les anticorps monoclonaux. Les aptamères sont des oligonucléotides d'ADN ou d'ARN simple brin dont la structure tridimensionnelle leur permet d'interagir spécifiquement avec une molécule cible. Ils constituent une bonne alternative aux anticorps monoclonaux et sont de puissants outils en infectiologie (outils de purification, détection, thérapeutique…). L'objectif de ma thèse était donc de transposer la technologie des aptamères à l'étude d'A. phagocytophilum. Deux approches ont été développées. La première a consisté à sélectionner des aptamères contre A. phagocytophilum ou des molécules exprimées au cours de l'infection, par la méthode d'enrichissement par contact avec la cible, appelée SELEX. Trois aptamères ont présenté une forte affinité vis à vis des cellules HL- 60 infectées par la souche humaine américaine NY18. Ils sont capables de reconnaitre des protéines exprimées à différents temps de l'infection. Cette approche est une première étape dans l'identification potentielle de nouvelles molécules d'intérêt en diagnostic/thérapeutique et en recherche. La seconde approche visait à sélectionner des aptamères contre la protéine de surface d'A. phagocytophilum, Asp14. Le SELEX a été effectué sur la protéine recombinante, via une plateforme robotisée. Huit aptamères spécifiques de la protéine Asp14 recombinante ont été obtenus, dont six reconnaissent leur cible dans une suspension enrichie en bactéries. Cette approche est notamment une première étape pour obtenir des aptamères contre les formes infectieuses d'A. phagocytophilum et pour développer une méthode de capture de la bactérie au sein de prélèvements. Mes travaux ont permis de confronter deux approches de sélection différentes, appliquées à un même modèle d'étude, A. phagocytophilum. Ils ouvrent la voie au développement d'aptamères contre d'autres bactéries pathogènes intracellulaires strictes, notamment vectorisées par les arthropodes, et à des pistes de recherche qui s'intègrent sur le long terme dans la démarche One Health (contribution à la lutte contre l'antibiorésistance, réduction de l'utilisation d'acaricides).
Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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