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Theses Year : 2020

Development of synthetic biology tools and construction of Yarrowia lipolytica chassis strains for aromatic molecules production

Développement d’outils de biologie synthétique et de souches châssis de Yarrowia lipolytica pour la production de molécules aromatiques

Abstract

To produce biobased products by microbial cell factories in a time and cost-effective way, the development of robust, versatile and well-characterized chassis strains is essential. The availability of efficient, standardized and characterized synthetic biology tools is crucial to build these chassis in a fast and efficient manner. These rationally engineered strains, based on an optimized supply of precursors, provide the foundations for the synthesis of a wide range of products.During this project, synthetic biology tools dedicated to the yeast Yarrowia lipolytica were developed. A modular cloning technique based on Golden Gate (GG) was set-up for assembling up to 13 modular building blocks via a single-step, one-pot reaction. The toolkit, composed of 64 bricks, proved to be a powerful tool for rapidly engineer Y. lipolytica strains with complex pathways and is perfectly suited for combinatorial approaches. In addition, based on the GG assembly method, a versatile and modular CRISPR-Cas9 system was set up for genome editing. A set of six platform vectors was constructed to easily introduce any gRNA and to be used in a wide range of different Y. lipolytica genetic backgrounds including wild-type strains. Both toolkits are available to the community through Addgene. These newly developed synthetic biology tools were used for the construction of Y. lipolytica tailor-made chassis strains optimized for the synthesis of aromatic amino acids (AAA), which are the precursors of many aromatic compounds. This platform strain was further engineered as a cell factory to produce aromatic compounds with industrial interest, 2-Phenylethanol, naringenin and melanin, as proof of concept.Thus, through the expansion of Y. lipolytica toolbox and the construction of an AAA-chassis strain, this work greatly enlarges the scope of possible studies and applications for this industrially relevant microorganism.
La production rapide et à moindre coûts de molécules par voie microbiologique nécessite le développement de souches châssis robustes, polyvalentes et bien caractérisées. De plus, la disponibilité d’outils de biologie synthétique performants et normalisés est cruciale pour construire ces souches de manière efficace. Ces organismes rationnellement conçus pour avoir une disponibilité optimisée de précurseurs, doivent servir de base pour la synthèse d’une large gamme de molécules.Lors de ce projet, des outils de biologie synthétique dédiés à la levure Yarrowia lipolytica ont été développés. Une technique de clonage modulaire basée sur la méthode Golden Gate (GG) a été mise en place pour assembler jusqu’à 13 blocs via une réaction en une seule étape. Le kit développé, composé de 64 briques, s’est révélé être un outil puissant pour l’ingénierie complexe de souches et est parfaitement adapté pour des approches combinatoires. De plus, un système polyvalent et modulaire de vecteur CRISPR-Cas9, basé sur la méthode GG, a été mis en place pour l’édition génomique. Six vecteurs plateforme ont ainsi été construits pour introduire facilement les gRNA et pour être utilisé dans n’importe quel fond génétique, y compris les souches sauvages. Ces deux boîtes à outils sont mises à disposition de la communauté par Addgene. Ces nouveaux outils ont été utilisés pour la construction de souches châssis de Y. lipolytica optimisées pour la synthèse d’acides aminés aromatiques (AAA), précurseurs de nombreuses molécules aromatiques. Cette souche plateforme a été transformée en usine cellulaire pour la production de composés aromatiques d’intérêt industriel, le 2-phényléthanol, la naringenine et la mélanine, comme preuve de concept.Ainsi, grâce à l’expansion des outils d’ingénierie pour Y. lipolytica et à la construction d’un châssis optimisé pour la production des AAA, ce travail élargit considérablement la portée des études et des applications possibles pour ce microorganisme d’intérêt industriel.
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  • HAL Id : tel-03243034 , version 1

Cite

Macarena Larroude. Development of synthetic biology tools and construction of Yarrowia lipolytica chassis strains for aromatic molecules production. Molecular biology. Université Paris-Saclay, 2020. English. ⟨NNT : 2020UPASA013⟩. ⟨tel-03243034⟩
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